Что вы знаете о деградации нуклеиновых кислот?

В ходе эксперимента нет ничего более душераздирающего, чем деградация нуклеиновых кислот, добытых с большим трудом. Почему нуклеиновые кислоты деградируют и как это предотвратить? Что вы знаете о деградации нуклеиновых кислот? Давайте узнаем больше о деградации нуклеиновых кислот.

Что такое нуклеиновые кислоты?

Нуклеиновая кислота — это разновидность полимерного соединения, а нуклеотид — это основная единица, составляющая нуклеиновую кислоту. Нуклеиновые кислоты гидролизуются с получением множества нуклеотидов, которые являются основными единицами нуклеиновых кислот, т.е. мономерами, составляющими молекулу нуклеиновой кислоты.

Молекула нуклеотида состоит из молекулы азотистых оснований, молекулы пятиуглеродных сахаров и молекулы фосфорной кислоты. В зависимости от пятиуглеродного сахара нуклеотиды можно разделить на дезоксирибонуклеотиды (ДНК) и рибонуклеотиды (РНК).

Деградация нуклеиновой кислоты — это гидролиз азогликозидной связи или фосфодиэфирной связи между основаниями и пентозным сахаром в молекуле ДНК/РНК в ответ на физические, химические и биологические факторы, которые разрушают цепь ДНК/РНК.

Причины деградации нуклеиновых кислот

Деградация ДНК вызвана многими факторами, в основном разделенными на физические, химические и биологические факторы.

1. Физические факторы: температура, механический сдвиг, многократное замораживание и оттаивание нуклеиновых кислот, высокотемпературное кипение и радиация.

2. Химические факторы: значение pH, реакция гидролиза, реакция окисления и т. д.

3. Биологические факторы: энзимолиз и микробное заражение.

一、Воздействие физических факторов

★ Температура: РНК нестабильна при высоких температурах и склонна к ускоренному гидролизу фосфодиэфирной связи, разрушая нуклеиновую кислоту.

★ Механический сдвиг: включая сильное встряхивание, перемешивание, внезапное помещение клеток в гипотонические растворы и быстрое прохождение растворов через узкие отверстия.

★ Многократное замораживание и оттаивание нуклеиновых кислот, кипячение при высоких температурах и радиация могут привести к деградации нуклеиновых кислот.

二、Химические факторы, влияющие на гидролиз

★ PH: Ионы водорода участвуют в катализе гидролиза фосфодиэфирных и гликозидных связей, но гликозидные связи более подвержены кислотному гидролизу, чем фосфодиэфирные связи. Слишком высокое или слишком низкое значение pH приводит к разрыву сложной связи. Нуклеиновые кислоты (особенно РНК) очень легко разлагаются в щелочных растворах.

★ Окисление: окисляет аммиаксодержащий гетероцикл в основании, денатурируя его и тем самым изменяя первичную и вторичную конформацию нуклеиновой кислоты.

★ Фенол окисляется на воздухе с образованием хинона, который способен генерировать свободные радикалы, которые при непосредственном использовании при выделении ДНК разрушают фосфатную связь и вызывают деградацию ДНК.

三、Воздействие биологических факторов

★ Ферментативное расщепление: Нуклеазы катализируют гидролиз фосфодиэфирных связей в полирибонуклеотидных цепях, непосредственно разрушая первичную структуру нуклеиновой кислоты и вызывая ее деградацию.

Нуклеазы (фосфодиэстеразы) Эндонуклеазы нуклеиновых кислот: Эндонуклеазы нуклеиновых кислот, которые обладают способностью распознавать определенные нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК в окружающей среде или в организме и, таким образом, расщеплять двухцепочечную ДНК, вместе известны как эндонуклеазы рестрикции. . Механизм действия начинается в середине полирибонуклеотидной цепи и разрезает фосфодиэфирную связь в определенном месте. Такие как ДНКаза, РНКаза и так далее.

Экзонуклеаза нуклеиновой кислоты. Механизм действия экзонуклеазы нуклеиновой кислоты заключается в гидролизе и вырезании нуклеотидов один за другим, начиная с одного конца (3'-конца или 5'-конца) полирибонуклеотидной цепи. Примеры включают фосфодиэстеразу змеиного яда и фосфодиэстеразу бычьей селезенки.

Нуклеотидаза (фосфомоноэстераза) Специфическая фосфомоноэстераза: 3'-нуклеотидаза, 5'-нуклеотидаза Неспецифическая фосфомоноэстераза.

★ Микробное заражение: микроорганизмы используют ДНК в качестве питательного вещества или выделяют химические вещества, содержащие ферменты.

Методы предотвращения деградации

Предотвращение деградации РНК:

★ Удалить загрязнение окружающей среды ферментом РНКазы или сильно подавить его активность.

★ Лучше всего извлекать РНК сразу после получения образца, если нет условий для проведения немедленных экспериментов, образец следует хранить в жидком азоте при температуре -80 ℃, а клетки следует лизировать путем измельчения при низкой температуре сразу после удаления образец во время экстракции, чтобы предотвратить деградацию РНК.

★ Используемые реагенты и расходные материалы необходимо замочить в воде DEPC, а затем автоклавировать.

★ На начальном этапе выделения и выделения тотальной РНК совместно использовать специфические ингибиторы РНКазы, чтобы максимально инактивировать активность внутриклеточной РНКазы.

★ Избегайте многократного замораживания и оттаивания образцов.

★ Обеспечьте качество лизата. Недостаточное количество лизата также приведет к деградации РНК.

★ После экстракции РНК храните при температуре -80°C во избежание разложения.

Методы предотвращения деградации ДНК:

★ Упростите этапы работы, сократите процесс экстракции, чтобы уменьшить разрушение нуклеиновых кислот различными вредными факторами.

★ Уменьшите деградацию ДНК химическими веществами, чтобы избежать разрушения фосфодиэфирной связи в двойной цепи ДНК из-за слишком большого количества кислоты и слишком большого количества оснований.

★ Чтобы предотвратить биодеградацию геномной ДНК, в основном деградацию геномной ДНК ДНКазой, ДНКаза требует активации катионов двухвалентных металлов, таких как Mg2+, использования ионов металлов, таких как ЭДТА, и других интегративных агентов для интеграции Mg2+ и ингибирования активности ДНКазы; ★ Уменьшить деградацию ДНК физическими факторами.

★ Уменьшить деградацию ДНК под действием физических факторов, факторы физической деградации в основном включают механический сдвиг (например, сильный удар, перемешивание и т. д.); ★ Избегайте многократного замораживания и оттаивания образцов.

★ Избегайте повторного замораживания и оттаивания образцов, ДНК можно хранить в буферном растворе.

★ Все реагенты следует готовить в стерильной воде, а расходные материалы автоклавировать.

★ Избегайте обработки ДНК при перегреве и т. д.