Que savez-vous de la dégradation des acides nucléiques ?

Au cours de l’expérience, il n’y a rien de plus déchirant que la dégradation d’acides nucléiques qui ont été extraits avec beaucoup de difficulté. Pourquoi les acides nucléiques se dégradent-ils et comment pouvons-nous l’éviter ? Que savez-vous de la dégradation des acides nucléiques ? Découvrons-en davantage sur la dégradation des acides nucléiques.

Que sont les acides nucléiques ?

L'acide nucléique est une sorte de composé polymère et le nucléotide est l'unité de base qui constitue l'acide nucléique. Les acides nucléiques sont hydrolysés pour obtenir de nombreux nucléotides, qui sont les unités de base des acides nucléiques, c'est-à-dire les monomères qui composent la molécule d'acide nucléique.

Une molécule nucléotidique est constituée d'une molécule de bases azotées, d'une molécule de sucres à cinq carbones et d'une molécule d'acide phosphorique. En fonction du sucre à cinq carbones, les nucléotides peuvent être classés en désoxyribonucléotides (ADN) et ribonucléotides (ARN).

La dégradation des acides nucléiques est l'hydrolyse de la liaison azoglycosidique, ou liaison phosphodiester, entre les bases et le sucre pentose dans la molécule d'ADN/ARN en réponse à des facteurs physiques, chimiques et biologiques qui brisent le brin d'ADN/ARN.

Causes de la dégradation des acides nucléiques

La dégradation de l’ADN est causée par de nombreux facteurs, principalement divisés en facteurs physiques, chimiques et biologiques.

1. Facteurs physiques: température, cisaillement mécanique, congélation et décongélation répétées des acides nucléiques, ébullition et rayonnement à haute température.

2. Facteurs chimiques : valeur du PH, réaction d'hydrolyse, réaction d'oxydation, etc.

3. Facteurs biologiques : enzymolyse et infestation microbienne.

一、Impact des facteurs physiques

★ Température : l'ARN est instable à haute température et est sujet à une hydrolyse accélérée de la liaison phosphodiester, dégradant l'acide nucléique.

★ Cisaillement mécanique : y compris secousses violentes, agitation, placement soudain de cellules dans des solutions hypotoniques et passage rapide de solutions à travers des orifices étroits.

★ La congélation et la décongélation répétées des acides nucléiques, l'ébullition à haute température et les radiations peuvent entraîner une dégradation des acides nucléiques.

二、Facteurs chimiques affectant l’hydrolyse

★ PH : Les ions hydrogène sont impliqués dans la catalyse de l'hydrolyse des liaisons phosphodiester et glycosidiques, mais les liaisons glycosidiques sont plus sensibles à l'hydrolyse acide que les liaisons phosphodiester. Une valeur de pH trop élevée ou trop basse a tendance à rompre la liaison complexe. Les acides nucléiques (en particulier l'ARN) sont très facilement dégradés dans les solutions alcalines.

★ Oxydation : oxyde l'hétérocycle contenant de l'ammoniac dans la base, le dénaturant et modifiant ainsi les conformations des acides nucléiques primaires et secondaires.

★ Le phénol est oxydé dans l'air pour former de la quinone, capable de générer des radicaux libres qui, lorsqu'ils sont utilisés directement dans l'isolement de l'ADN, briseront la liaison phosphate et provoqueront la dégradation de l'ADN.

三、Impact des facteurs biologiques

★ Clivage enzymatique : Les nucléases catalysent l'hydrolyse des liaisons phosphodiester dans les chaînes polyribonucléotidiques, détruisant directement la structure primaire de l'acide nucléique et provoquant sa dégradation.

Nucléases (phosphodiestérases) Endonucléases d'acide nucléique : les endonucléases d'acide nucléique qui ont la capacité de reconnaître des séquences nucléotidiques spécifiques dans une molécule d'ADN double brin dans l'environnement ou dans un organisme, et ainsi de cliver le double brin d'ADN, sont collectivement connues sous le nom d'endonucléases de restriction. . Le mode d'action commence au milieu de la chaîne polyribonucléotidique et coupe la liaison phosphodiester à un certain site. Tels que la DNase, la RNase, etc.

Exonucléase d'acide nucléique : le mode d'action de l'exonucléase d'acide nucléique consiste à hydrolyser et à exciser les nucléotides un par un, en commençant par une extrémité (extrémité 3′ ou extrémité 5′) de la chaîne polyribonucléotidique. Les exemples incluent la phosphodiestérase de venin de serpent et la phosphodiestérase de rate bovine.

Nucléotidase (phosphomonoestérase) Phosphomonoestérase spécifique : 3′-nucléotidase, 5′-nucléotidase Phosphomonoestérase non spécifique.

★ Infestation microbienne : les micro-organismes utilisent l'ADN comme nutriment ou sécrètent des produits chimiques contenant des enzymes.

Méthodes pour prévenir la dégradation

Prévention de la dégradation de l'ARN par :

★ Élimine la contamination de l'enzyme RNase dans l'environnement ou inhibe fortement son activité.

★ Il est préférable d'extraire l'ARN immédiatement après l'obtention de l'échantillon. S'il n'y a pas de conditions pour des expériences immédiates, l'échantillon doit être conservé dans de l'azote liquide à -80 ℃ et les cellules doivent être lysées par broyage à basse température immédiatement après avoir retiré l'ARN. échantillon pendant l’extraction pour éviter la dégradation de l’ARN.

★ Les réactifs et consommables utilisés doivent être trempés dans l'eau DEPC puis autoclavés.

★ Au stade initial de l'extraction et de l'isolement de l'ARN total, utilisez conjointement des inhibiteurs spécifiques de la Rnase pour inactiver autant que possible l'activité de la Rnase intracellulaire.

★ Évitez les congélations et décongélations répétées des échantillons.

★ Veiller à la qualité du lysat. Une quantité insuffisante de lysat entraînera également une dégradation de l’ARN.

★ Après extraction de l'ARN, conserver à -80°C pour éviter toute dégradation.

Méthodes de prévention de la dégradation de l'ADN :

★ Simplifiez les étapes opératoires, raccourcissez le processus d'extraction, afin de réduire la destruction des acides nucléiques par divers facteurs nocifs.

★ Réduire la dégradation de l'ADN par des produits chimiques, afin d'éviter la destruction de la liaison phosphodiester dans le double brin d'ADN par trop d'acide et trop de base.

★ Pour empêcher la biodégradation de l'ADN génomique, principalement la dégradation de l'ADN génomique par la DNase, la Dnase nécessite l'activation de cations métalliques divalents tels que Mg2+, l'utilisation d'ions métalliques, tels que l'EDTA et d'autres agents intégrateurs pour intégrer Mg2+ afin d'inhiber l'activité de la Dnase ; ★ Réduire la dégradation de l'ADN par des facteurs physiques.

★ Réduire la dégradation de l'ADN par des facteurs physiques, les facteurs de dégradation physiques comprennent principalement le cisaillement mécanique (par exemple choc violent, agitation, etc.) ; ★ Évitez les congélations et décongélations répétées des échantillons.

★ Évitez les congélations et décongélations répétées des échantillons, l'ADN peut être stocké dans une solution tampon.

★ Tous les réactifs doivent être préparés dans de l'eau stérile et les consommables doivent être autoclavés.

★ Évitez le traitement par surchauffe de l'ADN, etc.