¿Qué sabes sobre la degradación de los ácidos nucleicos?

Durante el experimento, no hay nada más desgarrador que la degradación de ácidos nucleicos que han sido extraídos con gran dificultad. ¿Por qué se degradan los ácidos nucleicos y cómo podemos prevenirlo? ¿Cuánto sabes sobre la degradación de los ácidos nucleicos? Descubramos más sobre la degradación del ácido nucleico.

¿Qué son los ácidos nucleicos?

El ácido nucleico es un tipo de compuesto polimérico y el nucleótido es la unidad básica que constituye el ácido nucleico. Los ácidos nucleicos se hidrolizan para obtener muchos nucleótidos, que son las unidades básicas de los ácidos nucleicos, es decir, los monómeros que forman la molécula de ácido nucleico.

Una molécula de nucleótidos consta de una molécula de bases nitrogenadas, una molécula de azúcares de cinco carbonos y una molécula de ácido fosfórico. Dependiendo del azúcar de cinco carbonos, los nucleótidos se pueden clasificar en desoxirribonucleótidos (ADN) y ribonucleótidos (ARN).

La degradación del ácido nucleico es la hidrólisis del enlace azoglucosídico, o enlace fosfodiéster, entre las bases y el azúcar pentosa en la molécula de ADN/ARN en respuesta a factores físicos, químicos y biológicos que rompen la cadena de ADN/ARN.

Causas de la degradación del ácido nucleico.

La degradación del ADN es causada por muchos factores, principalmente divididos en factores físicos, químicos y biológicos.

1. Factores físicos: temperatura, corte mecánico, congelación y descongelación repetidas de ácidos nucleicos, ebullición a alta temperatura y radiación.

2. Factores químicos: valor de PH, reacción de hidrólisis, reacción de oxidación, etc.

3. Factores biológicos: enzimólisis e infestación microbiana.

一、Impacto de factores físicos

★ Temperatura: El ARN es inestable a altas temperaturas y es propenso a la hidrólisis acelerada del enlace fosfodiéster, degradando el ácido nucleico.

★ Cizalla mecánica: incluye agitación violenta, agitación, colocación repentina de células en soluciones hipotónicas y paso rápido de soluciones a través de orificios estrechos.

★ La congelación y descongelación repetidas de los ácidos nucleicos, la ebullición a altas temperaturas y la radiación pueden provocar la degradación de los ácidos nucleicos.

二、Factores químicos que afectan la hidrólisis.

★ PH: Los iones de hidrógeno participan en la catálisis de la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster y glicosídicos, pero los enlaces glicosídicos son más susceptibles a la hidrólisis ácida que los enlaces fosfodiéster. Un valor de pH demasiado alto o demasiado bajo tiende a romper el enlace complejo. Los ácidos nucleicos (especialmente el ARN) se degradan muy fácilmente en soluciones alcalinas.

★ Oxidación: oxida el heterociclo que contiene amoniaco en la base, desnaturalizándolo y cambiando así las conformaciones primarias y secundarias de los ácidos nucleicos.

★ El fenol se oxida en el aire para formar quinona, que es capaz de generar radicales libres que, cuando se usan directamente en el aislamiento del ADN, romperán el enlace fosfato y provocarán la degradación del ADN.

三、Impacto de los factores biológicos.

★ Escisión enzimática: Las nucleasas catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster en las cadenas de polirribonucleótidos, destruyendo directamente la estructura primaria del ácido nucleico y provocando su degradación.

Nucleasas (fosfodiesterasas) Endonucleasas de ácido nucleico: las endonucleasas de ácido nucleico que tienen la capacidad de reconocer secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de ADN de doble cadena en el medio ambiente o en un organismo y, por lo tanto, escindir la doble cadena de ADN, se conocen colectivamente como endonucleasas de restricción. . El modo de acción comienza en el medio de la cadena de polirribonucleótidos y corta el enlace fosfodiéster en un sitio determinado. Como DNasa, RNasa, etc.

Exonucleasa de ácido nucleico: el modo de acción de la exonucleasa de ácido nucleico es hidrolizar y escindir los nucleótidos uno por uno, comenzando desde un extremo (extremo 3' o extremo 5') de la cadena de polirribonucleótidos. Los ejemplos incluyen la fosfodiesterasa del veneno de serpiente y la fosfodiesterasa del bazo bovino.

Nucleotidasa (fosfomonoesterasa) Fosfomonoesterasa específica: 3′-nucleotidasa, 5′-nucleotidasa Fosfomonoesterasa no específica.

★ Infestación microbiana: Los microorganismos utilizan el ADN como nutriente o secretan sustancias químicas que contienen enzimas.

Métodos para prevenir la degradación.

Prevención de la degradación del ARN mediante:

★ Eliminar la contaminación de la enzima RNasa en el medio ambiente o inhibir fuertemente su actividad.

★ Es mejor extraer el ARN inmediatamente después de obtener la muestra; si no existen condiciones para experimentos inmediatos, la muestra debe almacenarse en nitrógeno líquido a -80 ℃ y las células deben lisarse moliéndolas a baja temperatura inmediatamente después de retirar el muestra durante la extracción para evitar la degradación del ARN.

★ Los reactivos y consumibles utilizados deben remojarse en agua DEPC y luego esterilizarse en autoclave.

★ En la etapa inicial de extracción y aislamiento de ARN total, utilice conjuntamente inhibidores específicos de la Rnasa para inactivar la actividad de la Rnasa intracelular tanto como sea posible.

★ Evite la congelación y descongelación repetidas de las muestras.

★ Asegurar la calidad del lisado. Una cantidad insuficiente de lisado también provocará la degradación del ARN.

★ Después de la extracción del ARN, guárdelo a -80°C para evitar la degradación.

Métodos para prevenir la degradación del ADN:

★ Simplifique los pasos de la operación, acorte el proceso de extracción para reducir la destrucción de los ácidos nucleicos por diversos factores nocivos.

★ Reducir la degradación del ADN por productos químicos, para evitar la destrucción del enlace fosfodiéster en la doble cadena del ADN por demasiado ácido y demasiada base.

★ Para prevenir la biodegradación del ADN genómico, principalmente la degradación de la ADNasa del ADN genómico, la ADNasa requiere la activación de cationes metálicos divalentes como Mg2+, el uso de iones metálicos, como EDTA y otros agentes integrativos para integrar Mg2+ para inhibir la actividad de la ADNasa; ★ Reducir la degradación del ADN por factores físicos.

★ Reducir la degradación del ADN por factores físicos, los factores de degradación física incluyen principalmente cizallamiento mecánico (por ejemplo, choque violento, agitación, etc.); ★ Evite la congelación y descongelación repetidas de las muestras.

★ Evite congelar y descongelar repetidamente las muestras, el ADN puede almacenarse en una solución tampón.

★ Todos los reactivos deben prepararse en agua esterilizada y los consumibles deben esterilizarse en autoclave.

★ Evite el tratamiento del ADN con temperatura excesiva, etc.